本文将详细介绍南宫28在3T3-L1脂肪细胞诱导分化中的应用方案。3T3-L1细胞是一种经典的细胞系，最早于1974年由Green和Kehinde等人从小鼠胚胎成纤维细胞中分离得到。这种细胞系能够在体外成功分化为类脂肪细胞，广泛用于研究脂肪细胞的分化、代谢及肥胖和糖尿病等代谢性疾病的发病机制。

在诱导效果的评估中，油红O染色是一种经典的检测方法，它可以直观地反映细胞内脂滴的积累。油红O是一种脂溶性染料，能够特异性结合细胞内的中性脂质，形成红色脂滴。使用显微镜观察时，脂滴数量和大小的增加意味着诱导分化的成功。

此外，还可以通过检测脂肪细胞特异性基因或蛋白表达，进一步评估细胞的分化程度。常用的基因标志物包括PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、aP2（脂肪细胞脂肪酸结合蛋白）、LPL（脂蛋白脂肪酶）等。通过Western Blot检测这些标志物的表达水平，可以更加准确地评估细胞分化情况。

实验方案概述

本方案以六孔板为例，介绍南宫28在3T3-L1细胞分化为脂肪样细胞的实验步骤。

第一阶段：细胞培养

1. 将细胞以每平方厘米3×10³的密度接种于六孔板中。建议使用早代次的细胞以确保分化效果，且需要保持细胞均匀铺板，避免因铺板不均匀影响分化效果。

2. 在DMEM高糖培养基中培养细胞，添加10%小牛血清或胎牛血清，以促进细胞生长。每2-3天更换一次培养基，直到细胞汇合度达到70%。注意，分化前的汇合度不应超过70%，以免增加细胞死亡的风险。

第二阶段：分化诱导培养基配置

1. 培养基的制备必须在无菌条件下进行，确保MDI诱导培养基和胰岛素培养基为新鲜制备。

2. 在DMSO中制备IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液，使用冻干胰岛素时，需按照说明复溶。

3. 配置100 mL的MDI诱导分化培养基，包括：

• DMEM 100 mL
• IBMX 1 mL（终浓度5 mM）
• 地塞米松 100μL（终浓度1μM）
• 胰岛素 100μL（终浓度10μg/mL）

第三阶段：细胞分化

1. 从培养箱中取出细胞培养板，去除DMEM培养基，每孔添加2-3 mL MDI诱导培养基（记为第0天）。操作时应轻柔，加液时让枪头沿着侧壁慢慢加入，以减少对细胞的冲击。

2. 第3天，更换为2-3 mL胰岛素培养基，继续培养。

3. 第6天，去除胰岛素培养基，并添加新鲜的DMEM。一般在第7-10天时，可以观察到完全分化的脂肪样细胞。

4. 最后，通过油红O染色监测脂质积累，或通过脂肪细胞标志物（如脂联素和FABP4）的表达来追踪分化效果。

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