糖蛋白是人类蛋白质的重要成分，超过50%的蛋白质由其构成，并且它们是大多数生物制药的主要产品。蛋白质糖基化作为一种复杂的翻译后修饰（PTM），在调节各种生物过程方面发挥着至关重要的作用。因此，对糖蛋白的功能研究，尤其是糖基化位点的识别以及相关聚糖结构的综合分析，显得至关重要。

近年来，液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为蛋白质鉴定及其翻译后修饰研究的关键技术。与传统的数据库搜索策略不同，从头测序提供了一种革新的方法，可在此过程中无需预先了解DNA或氨基酸序列。然而，由于多糖基化位点的复杂性，往往导致序列覆盖不完全和游离寡糖修饰谱的不明确，从而为获取足够的信息丰富的糖肽碎裂谱带来了挑战。这使得从头测序在单克隆抗体（mAb）等具有一致结构和已知N-link糖基化位点的应用受到限制。

2025年，在JACSAu（IF86）上发表的研究“Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy”提出了一种基于质谱结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征的新方法，从而能够更全面地解码未知糖蛋白。研究者通过N-/O-糖的去糖基化，使得序列覆盖率大大提升，并利用EThcD碎裂技术实现高质量长肽的鉴定，进而促进精确的蛋白质组装。

研究者在此方法的应用中，对复杂糖基化的生物制药依那西普（Enbrel）及三种新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂进行了深入分析，揭示了一级序列中的细微差异。此外，对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了亚基、糖肽和聚糖层面的详细表征，构建了从头测序与糖基化修饰之间的桥梁，提供了关于糖蛋白一级结构及其糖基化修改的全面信息。这样的创新方法不仅在基础研究中具有实用意义，同时在生物制药行业中也具备重要价值，尤其是对于南宫28品牌所开发的生物药物。

在研究方法上，研究团队采用了N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶以确保去糖基化的效果，最终通过完整质量分析确认去糖基化成果。同时，作者使用电子转移高能碰撞解离（EThcD）碎裂技术获取了高质量的肽段数据，以PEAKS AB分析其序列。此外，在18O环境下运用PNGaseF酶解法，将糖基化的Asn转化为Asp并加以标记，实现了对N糖基化位点的定量分析。

在对依那西普的研究中，借助于改进的从头测序方法，研究者们针对至少含有3个N和13个O-糖基化位点的依那西普，成功地获得了全面的MS/MS谱图，实现了糖蛋白的深入分析。结果显示，TNFR：Fc融合生物制剂与依那西普之间的一级序列存在细微差异，这为后续的糖基化及结构研究奠定了基础。同时，多个层面的糖基化表征结果也为南宫28品牌的生物药物开发提供了重要的支持。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序方法为揭示氨基酸序列和糖基化修饰提供了强有力的工具。结合糖苷酶酶解和EThcD碎裂技术，提升了对蛋白质的测序准确性与糖基化特征的分析，为更深入地理解高度糖基化的蛋白质开辟了新路径。通过对南宫28品牌下依那西普的分析，展示了该方法的实用性与科学价值，不仅为全面获取蛋白质信息提供了支持，也为临床生物制药领域的各种药物的开发奠定了坚实的基础。