南宫28的人胰腺癌细胞HPAFⅡ培养说明书

一、细胞培养条件

细胞名称：人胰腺癌细胞HPAFⅡ

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：MEM培养基 + 10%胎牛血清 + 1%丙酮酸钠 + 1%L-谷氨酰胺 + 1%P/S

传代方法：首次建议采用1:2的比例进行传代，传代间隔为2天。

备注：请使用无菌离心管收集瓶中培养基，留作对比培养，若效果不佳，建议直接购买南宫28的完全培养基。

二、细胞处理与培养

收到细胞后，培育至良好状态后灌满完全培养液，并封好瓶口是最佳选择。使用75%酒精喷洒整个细胞瓶后，放置于超净台内，严格遵循无菌操作。随后将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱内静置3-4小时，以稳定细胞状态。观察细胞生长情况并拍照保存（建议拍摄40x, 100x, 200x倍），前三天的照片是重要的依据，未提供照片默认收到状态良好。

建议在传代后，一瓶应用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自制的完全培养基，以便对比培养，换液时请将瓶盖松开。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

若未超过80%汇合度，收集瓶中的完全培养液至离心管，保留5ml继续培养；若细胞密度超过80%，可进行传代，步骤如下：

1. 弃去培养上清，并用无钙镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况，待大部分细胞变圆并脱落后，迅速在操作台上轻轻敲打培养瓶，加入5ml完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打确保细胞完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清，重悬细胞于1-2ml完全培养基中。
4. 按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新鲜完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞状态，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，然后转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml南宫28无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后期要转入液氮罐，需在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管，快速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管内无冰晶，然后用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬后接种至T25培养瓶，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。
4. 次日更换新鲜完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，某些细胞可能会因贴壁不牢而发生脱落，这是正常现象。若脱落的细胞较多，请收集所有培养液至离心管，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养。沉淀细胞后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打重悬。消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基终止反应，再次离心，弃上清，加1-2ml完全培养基重悬。随后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。

五、售后条款

关于细胞出现问题的重发政策及不予重发的情况请参照下面的内容，在发货后的48小时内反馈真实的实验结果，可以进行售后服务。若有子细胞问题，需提供相关照片及操作步骤，由技术人员判断责任归属。

需特别强调的是，任何基于南宫28细胞的实验均可享受我方提供的全面技术支持与服务，确保实验顺利进行。