荧光实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR，qPCR）是现代分子生物学中最为重要及应用广泛的核酸定量检测技术。成功的定量PCR实验依赖于精准的实验设计和操作流程。为了确保实时荧光定量PCR分析的准确性，所有反应参数需经过优化设置。尽管PCR实验操作相对简单，但在实践中仍可能面临各类问题。以下是针对PCR实验中常见问题的详细解答。

01. 无Ct值检测结果

当遇到无Ct值的情况时，应检查以下问题：

• 循环数是否不足（一般不超过45循环，否则定量会不准确）；
• PCR程序设定错误，荧光信号采集步骤有误。SG法通常在72℃延伸时采集，而TaqMan法在退火结束或延伸时采集信号，确保荧光采集选项已选中；
• 引物或探针可能降解。可通过PAGE电泳检测其状况；
• 模板量可能降解或上样量不足（一般不超过500ng）；最好从最高浓度的系列稀释样本开始；保持模板样本小量分装以避免反复冻融；
• 引物探针是否合适，尤其是引物设计要跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物Tm值需相差不超过4℃。

02. 标准曲线不佳

若标准曲线线性关系不良（R²<0.9），可能存在以下问题：

• 标准品稀释或加样误差，导致标准品未呈现梯度；
• 标准品发生降解。需避免反复冻融，建议将高浓度DNA模板分装并储存在-20℃或-80℃；
• 引物或探针效率不佳，考虑重新设计更稳定的引物；
• 模板中可能存在抑制物，确保模板浓度在50-500ng范围内。

03. Ct值过晚

在相对定量中，Ct值应控制在15-25之间；而在绝对定量中，Ct值对于低拷贝样品可能会增大，但通常不应超过40循环。判断Ct值是否异常需要结合实验设计：

• 扩增效率低，需优化引物或探针比例；
• PCR程序不合适，考虑使用三步法或优化退火/延伸温度；
• MgCl2浓度不当，适当增加镁离子浓度；
• PCR产物设计过长，确保产物长度不超过500bp；
• 模板中存在抑制物，建议使用高纯度模板。

04. 熔解曲线峰不特异

若熔解曲线峰不特异，可能存在如下问题：

• 引物设计不够优化，避免引物二聚体和发夹结构；
• 模板有基因组污染，确保在RNA提取过程中避免引入基因组DNA；
• 离子浓度不合适，适当降低镁离子浓度并选择合适的试剂盒。

05. 阴性对照扩增有信号

若阴性对照出现信号，需排查以下环节可能存在的问题：

• 引物设计不合理，避免引物二聚体和发夹结构；
• 引物浓度不适宜，注意上下游引物浓度比；
• 镁离子浓度过高，需降低镁离子浓度；
• 模板中存在基因组污染，建议在RNA提取过程中避免引入基因组DNA；
• 可能存在交叉污染，需清理操作环境或更换新的耗材。

06. 扩增曲线异常

面对扩增曲线异常，如“S”型曲线等，可考虑以下问题：

• 模板浓度过高或降解；
• 荧光染料降解；
• 操作时接触液体、消耗品造成污染；
• 液体蒸发，确保耗材的气密性；
• 气泡问题，操作不当引起气泡。

07. 扩增效率低

若所有基因，尤其是内参基因无法获得满意扩增信号，应考虑如下情况：

• 反应试剂中成分比例是否最佳，考虑荧光染料是否降解；
• 反应条件不够优化，适当调整退火温度及延长时间；
• 反应体系中存在PCR抑制物，需适度稀释模板。

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