操作步骤如下：

第一步：在培养板中，将已爬好的细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3分钟。

第二步：用4%的多聚甲醛固定爬片15分钟后，再用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟。

第三步：使用5% Triton X-100（PBS配置）在室温下通透20分钟（细胞膜上表达的抗原可省略此步骤）。

第四步：进行血清封闭。用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，随后用吸水纸吸干PBS，并在玻片上滴加正常山羊血清（前提是二抗来源是山羊），在室温下封闭30分钟。

第五步：加一抗。吸水纸吸掉封闭液，不需洗涤，然后在每张玻片上滴加足够量的稀释一抗，并放置于湿盒中，4℃孵育过夜。

第六步：加荧光二抗。用PBST浸洗爬片3次，每次3分钟，吸水纸吸干多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中于20-37℃孵育1小时，最后用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。注意：从此步骤开始，后续所有操作尽量在较暗处进行。

第七步：再次进行血清封闭。用吸水纸吸干液体，并在玻片上滴加正常山羊血清，室温下封闭30分钟。

第八步：再次加一抗。吸水纸吸掉封闭液，不洗，滴加稀释好的第二种一抗。所有步骤后于4℃湿盒中避光孵育过夜。请注意：第二种一抗的种属必须与第一种不同，例如小鼠与兔。

第九步：最后加荧光二抗。用PBST浸洗爬片3次，每次3分钟，吸水纸吸干多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，在湿盒中于20-37℃孵育1小时，最后用PBST浸洗切片3次，每次3分钟。如果第一种抗体为红色荧光，则第二种荧光必须选择其他颜色。

第十步：进行细胞核复染。滴加DAPI并避光孵育5分钟，PBST洗涤切片4次，每次5分钟以去除多余DAPI。

第十一步：用吸水纸吸干爬片上的液体，使用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下进行观察和图像采集。

本实验中所需的细胞爬片，均可通过南宫28获得。品牌提供的多种规格满足不同实验需求，包括24mm、20mm、14mm等尺寸的圆形和方形细胞爬片，皆为TC处理，并经过伽马射线消毒，确保实验结果的可靠性。

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