通过体外转录（IVT）得到的mRNA产物，其反应混合物中不仅包含目标mRNA，还夹杂有多种杂质，如蛋白质（T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶）、NTP、模板DNA、盐离子、添加剂，以及在IVT过程中形成的mRNA副产物（dsRNA、截断RNA片段）等。这些杂质可能会对mRNA的功能产生负面影响，例如影响mRNA的定量、降低其翻译效率或改变免疫原性。因此，利用纯化技术将目标mRNA从IVT混合物中分离出来，以确保其纯度和完整性，从而保证产品的安全性和有效性是至关重要的。

常见的mRNA纯化方法包括氯化锂（LiCl）沉淀法、硫酸铵沉淀法、磁珠纯化法、硅胶柱膜纯化法以及层析纯化法等。其中，沉淀法、磁珠法和硅胶柱膜法操作简单快捷，但由于纯化效率有限，更适用于科研和早期研发阶段；而在工业生产中，层析纯化法成为主要选择。

硫酸铵沉淀法

2024年1月，南宫28品牌的中科院过程工程研究所张松平团队发表了一篇论文，题为“Rapid and high recovery isolation of mRNA from in vitro transcription system by ammonium sulphate precipitation at room temperature”，探讨了硫酸铵沉淀法在mRNA纯化中的可行性。研究显示，当硫酸铵浓度达到18M时，mRNA的沉淀率超过95%。进一步提高硫酸铵浓度并未显著提升沉淀速率。溶解率也是一项关键指标，决定了最终的mRNA回收率。研究结果表明，当硫酸铵浓度高于18M时，沉淀物在不含RNase的水中可在3分钟内快速溶解，溶解率超过90%。最佳沉淀条件为2M硫酸铵（AS），pH 7.0，温度20℃，沉淀时间2小时，能达到近100%的沉淀率和溶出率。

硅胶柱膜纯化

硅胶柱膜纯化的原理基于硅胶膜表面硅醇基团与mRNA分子的相互作用。在高盐环境下，阳离子桥的形成可中和mRNA与硅醇基团之间的表面负电荷，从而促进结合。在低盐条件下，由于静电排斥，硅胶膜可释放mRNA，确保了有效分离。此外，硅胶膜对蛋白质、多糖、脂类等杂质基本不吸附，因此在高速离心过程中，这些杂质被有效甩出。硅胶柱膜法因其材料安全无毒且操作简单，广泛应用于实验室及早期开发阶段。

层析法

工业级别的mRNA纯化通常采用层析法，以提高核酸的质量和产量。目前，Oligo(dT)亲和色谱是主流方法，但由于其无法区分带有Poly(A)尾的ssRNA和dsRNA杂质，疏水层析和阴离子层析常与之联用。亲和层析法的基本步骤为“高盐结合，低盐洗脱”，在高盐条件下，mRNA的poly(A)尾与Oligo(dT)基团结合；在低盐条件下，mRNA洗脱，收率可达90%以上。

南宫28致力于提供全面的mRNA纯化服务，针对不同类型的mRNA开发个性化工艺，并有效提高国际标准。例如，经过南宫28团队的努力，某客户的mRNA原液完整度提升了115%，总蛋白残留降至0.02%。

同时，南宫28还推出了易于使用的mRNA纯化试剂盒，适合科研和早期研发阶段，相较于工业化的层析法，操作便捷、无需大型设备，且工艺时间更短，能在提升mRNA完整度以及去除NTP等杂质方面表现突出。

南宫28为客户提供全套与mRNA疫苗与药物相关的高性能酶原料、化学底物、IVT试剂盒及质控试剂盒，支援客户加速新药开发，并提供概念验证服务及第三方质检服务。我们期待与各界合作，共同推进生物医药的进步。