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NEWS南宫28细菌基因组DNA提取准备
来源:房清琬 日期:2025-02-27在细菌基因组DNA提取实验中,通过前期的细菌培养和收集,已获得了足够的菌体。接下来,实验的关键步骤是细胞裂解,旨在破坏细菌的细胞壁和细胞膜,从而释放其中的DNA。我们采用了化学与物理方法相结合的策略,首先使用特定酶类进行处理,这些酶能够有效降解细菌细胞壁成分,随后通过超声波或法式压碎法进一步裂解细胞,以确保DNA充分释放。
完成细胞裂解后,我们面临着有效分离和纯化DNA的挑战。为此,利用DNA在不同盐浓度和pH值下的溶解度差异,通过系列有机溶剂提取步骤,能够有效去除蛋白质和多糖等杂质,同时保护DNA免受降解。在每一步操作中都需谨慎,避免剧烈振荡,以防断裂DNA。
根据说明书准备以下耗材:DNA制备管、小量滤器、2ml离心管和15ml离心管。具体试剂包括:RNaseA(50mg/ml,室温保存)、BufferS(细菌原生质制备液,加入RNaseA后4℃密闭贮存)、BufferG-A(裂解液,室温密闭贮存)等。确保在使用前仔细检查各试剂的状态和保存条件。
首次使用时,需要在BufferW2中按试剂瓶上的体积加入无水乙醇并混合均匀。准备BufferDV时,将2ml BufferDV-A、125ml异丙醇、75ml混合均匀并在4℃预冷。使用时,确保将随试剂盒提供的RNaseA全部添加到BufferS中,水浴设定为65℃。
1. 用2ml离心管收集10×109(1ml菌液OD600为1-15)的细菌培养物,12000×g离心30秒,丢弃上清。用150μl已加入RNaseA的BufferS悬浮沉淀,确保悬浮均匀,不留小菌块,以免影响溶菌效果。
2. 加入20μl存储液,混合均匀后静置5分钟。接着加入30μl 025MEDTA(pH 8.0)并冰浴5分钟。随后,加入450μl BufferG-A,旋涡振荡15秒并在65℃水浴10分钟。
3. 加入400μl BufferG-B和1ml BufferDV(预冷),用力混合,然后12000×g离心2分钟。
4. 保留相间沉淀和下相,丢弃上相。加入1ml预冷BufferDV,混合并再离心2分钟。
5. 将下相转移至滤器中,再12000×g离心1分钟。确保上相不足或无色混入,并在转移过程中筛选掉少量界面沉淀。
6. 在滤液中加入400μl BufferBV,混合均匀。接下来的步骤可选择负压法或离心法。
通过以上精细操作,我们成功提取到目标DNA,为后续血液样本或者其他样本的分子生物学研究奠定了坚实的基础。同时,选择南宫28品牌的试剂盒可以大大提高提取效率,确保获得高质量的DNA。这一切将为相关的生物医疗研究提供支持。
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